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細(xì)菌基因組測(cè)序/小基因組測(cè)序(10K~1M的DNA序列)

       細(xì)菌不但個(gè)體微小，其基因組也比動(dòng)植物小得多，一般在10M以內(nèi)。微生物基因組測(cè)序能夠檢測(cè)微生物全基因組的核苷酸變異，通過(guò)全基因組測(cè)序，研究人員可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)、拷貝數(shù)變異(CNV)、插入缺失(InDel)、結(jié)構(gòu)變異(SV)等變異信息，應(yīng)用范圍涉及臨床醫(yī)藥研究、微生物致病性研究、物種進(jìn)化分析等領(lǐng)域。

       1、實(shí)驗(yàn)方案

    測(cè)序策略：Illumina MiSeq PE250/PE300

     數(shù)據(jù)量：推薦測(cè)100×以上

2、數(shù)據(jù)分析

 2.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析

（1）按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

（2）K-mer分析以及基因組大小估計(jì)

（3）序列組裝

（4）組裝基因組的深度和覆蓋度分析

（5）組裝結(jié)果的核酸庫(kù)比對(duì)分析

（6）基因預(yù)測(cè)

（7）基因功能注釋(GO-COG/KOG)

（8）基因生物通路注釋(KEGG)

 2.2 高級(jí)信息分析

（1）基因組詳細(xì)信息環(huán)形圖

（2）共線性分析

（3）基因家族分析

（4）CRISPR預(yù)測(cè)

（5）基因島預(yù)測(cè)（毒力島）

（6）前噬菌體預(yù)測(cè)

（7）分泌蛋白預(yù)測(cè)

（8）動(dòng)植物病原菌致病性分析等

 3、技術(shù)流程

4、案例分析

案例（1）高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)新細(xì)菌

德國(guó)微生物學(xué)與細(xì)胞培養(yǎng)研究所微生物系最近從咸水環(huán)境微生物墊的低氧過(guò)渡區(qū)中分離培養(yǎng)獲得了一種中度嗜鹽，專性厭氧，分解糖類的細(xì)菌，并編碼代號(hào)為L(zhǎng)12-Fru-AB^T。利用16s測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)該微生物應(yīng)該代表著一個(gè)新的種屬，研究發(fā)現(xiàn)該菌在各種缺/微氧環(huán)境中都廣泛存在，比如咸水環(huán)境，沸水和動(dòng)物腸道；隨后，研究人員利用全基因組測(cè)序方法對(duì)該菌進(jìn)行基因組序列分析，結(jié)合該菌的表型，推斷出L12-Fru-AB^T該菌及其相關(guān)細(xì)菌是能夠?qū)ｉT適應(yīng)和利用微生物墊或生物膜產(chǎn)生的硫酸化的甘油聚合物。

圖1 基于16s rRNA基因測(cè)序的L21-Fru-AB^T在發(fā)育樹(shù)的位置圖

圖2 K.glycovorans L21-Fru-AB^T和幾個(gè)PVC superphylum的代表性細(xì)菌的基因組系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)成成分

案例（2）耐鹽耐堿性的克雷伯氏菌.D5A全基因組分析

中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所研究人員利用Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)，采用Pair-end測(cè)序和mate pair測(cè)序的技術(shù)對(duì)克雷伯氏菌.D5A種屬進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了系統(tǒng)性分析。研究其有利于促進(jìn)植物生長(zhǎng)的相關(guān)基因，尤其是與耐鹽耐堿等相關(guān)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)克雷伯氏菌.D5A種屬的基因組共為5,540,009bp，GC含量占57.15%，同時(shí)注釋了一些基因比如3-吲哚乙酸（IAA）合成基因，溶磷作用基因，含體細(xì)胞生成基因，羥基丁酮和2,3-丁二醇合成基因，還有固氮功能基因等。

圖1 Klebsiella sp. D5A種屬代謝通路和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)一覽圖

       參考文獻(xiàn)