miRNA是一類高度保守的小RNA分子，它可以參與基因表達(dá)與調(diào)控、RNA的加工與剪切、蛋白質(zhì)翻譯、遺傳“入侵”抑制、配子發(fā)生等重要生物學(xué)過程，是生命活動(dòng)中必不可少的調(diào)控因子。miRNA測(cè)序技術(shù)采用膠分離技術(shù)，收集樣本中18-30nt的RNA片段，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本中所有small RNA家族進(jìn)行測(cè)序和表達(dá)定量，從而解析miRNA 、siRNA 、piRNA 其它非編碼RNA等序列，并預(yù)測(cè)新的小RNA及其靶基因。
1、實(shí)驗(yàn)方案
測(cè)序策略：Illumina 平臺(tái) SE50
數(shù)據(jù)量：10M clean reads
2、技術(shù)優(yōu)勢(shì)
（1）通量高：一次測(cè)序得到上千萬條序列；
（2）分辨率高：可以檢測(cè)小RNA單個(gè)堿基的差異；
（3）精準(zhǔn)度高：從幾個(gè)到幾十萬個(gè)拷貝精確計(jì)數(shù)；
（4）可重復(fù)性好：深度測(cè)序保證了抽樣隨機(jī)性，重復(fù)性好，無需重復(fù)實(shí)驗(yàn)；
（5）檢測(cè)范圍廣：既能鑒定已知小RNA，又能發(fā)現(xiàn)新的小RNA。
3、信息分析
3.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析
（1）按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估；
（2）樣品間的公共序列和特異序列分析；
（3）小RNA與參考基因組比對(duì)分析；
（4）按照優(yōu)先級(jí)將小RNA進(jìn)行分類注釋
（5）Novel Small RNA預(yù)測(cè)；
（6）樣本間miRNA差異表達(dá)分析；
（7）已知miRNA的家族分析；
（8）已知miRNA差異分析（≥2個(gè)樣本）和聚類分析（≥3個(gè)樣本）；
（9）已知miRNA和novel miRNA的靶基因預(yù)測(cè)；
（10）已知miRNA和novel miRNA的靶基因GO注釋和KEGG通路分析；
（11）novel miRNA差異分析（≥2個(gè)樣本）和聚類分析（≥3個(gè)樣本）；
（12）差異miRNA靶基因預(yù)測(cè)；
（13）已知miRNA的堿基編輯分析；
3.2 高級(jí)信息分析
（1）snoRNA注釋
（2）piRNA注釋
（3）mir2disease注釋
4、技術(shù)流程
5、案例分析
案例（1）小鼠早期胚胎發(fā)育過程中小RNA的動(dòng)態(tài)變化及其生物學(xué)功能
該研究利用優(yōu)化的方法系統(tǒng)解析了小鼠卵子到受精后8細(xì)胞胚胎發(fā)育過程中的小RNA動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)小鼠卵子和早期胚胎主要包含三類小RNA：endo-siRNA、piRNA和miRNA。受精卵中的這三類小RNA絕大多數(shù)來源于卵子，由精子帶入卵子的小RNA不足幾百分之一。隨著胚胎的發(fā)育，母源endo-siRNA和piRNA逐漸被緩慢降解。而母源miRNA的降解較快，主要發(fā)生在胚胎2細(xì)胞期前后。合子中新表達(dá)的miRNA最早出現(xiàn)在受精卵第一次分裂前，并隨著胚胎的發(fā)育持續(xù)被激活表達(dá)，特別是進(jìn)化保守的miRNA的表達(dá)量迅速上升。研究人員進(jìn)一步結(jié)合小鼠早期胚胎發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miRNA在卵子到胚胎2細(xì)胞期中幾乎沒有降解靶基因mRNA的功能，而在4-8細(xì)胞期中miRNA降解靶基因mRNA的功能開始逐步恢復(fù)，并對(duì)合子激活表達(dá)的基因有明顯的靶向抑制作用。以上研究不僅揭示了小鼠早期胚胎發(fā)育中miRNA的表達(dá)和降解規(guī)律，還發(fā)現(xiàn)了miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控活性隨著胚胎發(fā)育而被動(dòng)態(tài)調(diào)控的現(xiàn)象，對(duì)于理解miRNA在早期胚胎發(fā)育中的功能和機(jī)制具有重要意義。
案例（2）人前列腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞小RNA深度測(cè)序展示miRNA的差異類型并首次預(yù)測(cè)靶點(diǎn)生長(zhǎng)因子
本研究通過高通量測(cè)序方法對(duì)小RNA長(zhǎng)度進(jìn)行分類，繪制前列腺上皮（PrEC）和間質(zhì)細(xì)胞（PrSC）miRNA圖譜。PrEC測(cè)序共得到近76M reads，其中860468條為特異性序列。PrSC測(cè)序得到近76M reads，其中1百萬條為特異性序列。鑒定得到許多高度保守及不保守的miRNA家族。與PrEC相比，16條在PrSC中顯著高表達(dá)的miRNA得到進(jìn)一步分析。結(jié)果表明，這16條miRNA的靶點(diǎn)基因主要涉及附著連接、細(xì)胞附著、EGRF、TGF-β和雄激素信號(hào)。腫瘤抑制Let-7家族miRNA在兩株細(xì)胞中高度表達(dá)。此外，鑒定得到PrEC和PrSC細(xì)胞中特異性表達(dá)的miRNA，預(yù)測(cè)它們的作用靶點(diǎn)為一組轉(zhuǎn)錄因子。
參考文獻(xiàn)
[1] Yang et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances, 2016.
[2] Singh et al. Deep sequencing of small RNA libraries from human prostate epithelial and stromal cells reveal distinct pattern of microRNAs primarily predicted to target growth factors. Cancer Letters, 2016.
